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                                            反義RNA技術在食品工業中的應用 - 下載本文

                                            云南農業大學

                                            反義RNA技術在食品工業中的應用

                                            姓名:李曉莉 專業:食品質量與安全

                                            班級:2012級食品質量安全1班 學號:2012310093 指導老師:馮勵 日期:2014年10月8日

                                            反義RNA技術在食品工業中的應用

                                            摘要:隨著反義RNA的發現及對其研究的深入,反義RNA技術已被廣泛應用于食品工業的研究中。本文介紹了反義RNA的概念,并就反義RNA的作用機理和在食品工業領域的應用進行了綜述。反義RNA最初在原核細胞中被發現并廣泛存在于多類生物中,通過與mRNA互補結合形成雜交鏈而抑制基因的表達,作用于DNA的復制、轉錄、翻譯的過程,實現對基因表達的調控。反義技術是最近20年來發展的一門全新的基因工程技術, 它是從反向遺傳學的角度來認識結構基因的功能和基因表達的調控。反義RNA技術是借助基因重組技術根據堿基互補原理用人工合成或生物體合成的特定RNA片段或其化學修飾物抑制或封閉基因表達的技術。目前人們利用反義RNA技術的這一特點,在食品工業這一領域對生物基因進行有效調控并取得了顯著的成就,并且這項技術具有極其廣泛的應用前景,也將開辟一個新的領域。

                                            關鍵詞:反義RNA技術 基因工程 食品工業 應用

                                            Antisense RNA technology application in food industry

                                            Industry

                                            With the discovery of antisense RNA and the deepening of research, antisense RNA technology has been widely used in the food industry research This paper introduces the concept of antisense RNA and antisense RNA mechanism and applications in food industry are reviewed.Abstract:Antisense RNA was originally discovered in prokaryotic cells and widely exists in many biological, combined with complementary mRNA hybridization to form chain and inhibit the expression of genes, role in the process of DNA replication, transcription, translation, realize the regulation of gene expression. Antisense technology is developed in recent 20 years of a new genetic engineering technology, it is from the perspective of reverse genetics knowledge structure gene function and gene expression regulation. Antisense RNA technology is with the aid of genetic recombination according to the principle of complementary base with synthetic or synthetic organism specific RNA or inhibit or closed its chemical membranes.It technology of gene expression. There are the characteristics of antisense RNA technology, in the field of biological genetic food industry for effective control and has made remarkable achievements, and this

                                            technology has the extremely widespread application prospect, will also open up a new field.

                                            Key words:Abstract:Antisense RNA genetic engineering food industry application

                                            隨著基因工程技術的蓬勃發展和代謝調控研究的深入, 反義技術作為一種溫和調控的基因工程技術, 開始向世人展示其無窮的魅力。反義基因的概念、分子生物學基礎以及作用原理, 對反義基因技術及其在現代植物研究中的應用進行了概述。與基因敲除等功能缺失性研究方法相比, 反義技術具有投入少、周期短、操作簡單等優點。反義技術是最近20年來發展的一門全新的基因工程技術, 它是從反向遺傳學的角度來認識結構基因的功能和基因表達的調控。本文介紹近年來反義基因技術在食品工業中的應用的研究進展,其中以反應基因技術在植物性食品原料生產,儲藏方面的應用為主。反義RNA技術是借助基因重組技術, 根據堿基互補原理, 用人工合成或生物體合成的特定RNA片段 (或其化學修飾物)抑制或封閉基因表達的技術.在食品原料反義RNA 技術主要應用于果實性狀及品質的調控,食品原料儲藏期的調控。

                                            1. 反義技術

                                            反義技術是20世紀八十年代提出的一種全新的基因工程技術。它是從反向遺傳學的角度認識結構基因的功能和基因表達的調控。根據目前的研究,反義技術可以定義為:根據堿基互補原理,用人工合成或生物體合成的特定互補的DNA或RNA片段(或其化學修飾產物),導入靶細胞,形成mRNA-DNA或mRNA-RNA雜交雙鏈,從而抑制或封閉基因表達,使其喪失活性,達到基因控制和治療的目的。

                                            2. 反義RNA技術

                                            反義RNA技術是反義技術中一種重要的基因工程技術。它是指能與特定mRNA互補結合的RNA片段。這種反義RNA與mRNA形成1個雙體結構,從而阻止mRNA有效翻譯。反義RNA一直被認為存在于原核生物中,但1986年,Williams發現真核細胞中也存在天然的反義RNA。目前,實現反義RNA抑制基因表達的方法具體說有3種。第1種是把合成的一段短的反義寡核苷酸直接導入細胞;第2種是將反義RNA與表達載體相連,然后將表達載體導入細胞,實現反義RNA的轉錄; 反義基因以相反的方向插入到特異的啟動子和終止子之間。在轉錄時其與特異的目的基因片段互補結合。第3種就是RNA干涉。反義RNA可以從復制、轉錄、翻譯

                                            等3個水平上發揮功能。在復制水平上,反義RNA可作為DNA復制的抑制因子,它可與引物RNA前體互補結合,抑制DNA的復制,從而控制復制頻率。在轉錄水平上,反義RNA可與mRNA 5′末端互補而阻止RNA的轉錄。反義RNA更主要的調控功能表現在翻譯水平上。如在原核生物反義RNA可與mRNA 5′端編碼區包括SD序列的結合,直接抑制翻譯;或與mRNA 5′端編碼區主要是起始密碼子AUG結合抑制翻譯起始;或是與靶mRNA的非編碼區互補結合,使mRNA構象改變,影響其與核糖體結合間接抑制了mRNA的翻譯。在真核生物中反義RNA的調控方式主要有:影響mRNA前體的剪接;影響mRNA前體的轉移;影響真核mRNA分子5′和3′端正常的修飾,如加帽和加尾的修飾等。反義RNA的作用機理被不斷地揭示出來,還有人認為,反義RNA會激活RNase H, RNase H專一性降解DNA-RNA雜合雙鏈中的RNA,造成轉錄過程中尚未從DNA模板上剝離下的RNA鏈被降解。

                                            3. 反義 RNA的作用機理

                                            反義RNA被發現后, 其調控機理的研究引起了生物學者的廣泛重視.。不同的反義RNA其功能和作用方式不盡相同, 它們可以在基因的復制、轉錄、翻譯等3個水平上發揮功能。反義RNA技術是借助基因重組技術, 根據堿基互補原理, 用人工合成或生物體合成的特定RNA片段 (或其化學修飾物 )抑制或封閉基因表達的技術。

                                            3.1 反義RNA的獲得

                                            反義RNA既可采用重組技術獲得, 也可在實驗室人工合成。 導入反義 RNA 的方法有2種: 一種是插入法, 通過cDNA文庫路線構建反義RNA基因, 通過載體將其插入到受體染色體上, 并隨受體基因的表達而表達另一種是注射法, 即將反義RNA直接注射到受體細胞內, 干擾 mRNA的翻譯過程, 從而起到短時間的抑制作用。這一方法對那些不能獲得穩定轉化的, 或是啟動子不能有效表達的細胞系統尤為適合。

                                            3. 2表達載體的構建

                                            利用基因重組技術, 在適宜的啟動子和轉錄終止子間插入一段靶基因, 構成人工反義 RNA基因表達載體.當它引入細胞時將合成反義 RNA。構建表達載體的具體步驟如圖 1所示分離信使 RNA (1)作為合成互補DNA鏈的模板(2), 以DNA (3) 作為有義DNA鏈的模板,生成雙鏈DNA〔4〕. 用內切酶在近啟動子區

                                            切開質粒 (5). 將雙鏈 DNA 拼接入質粒, 形成表達載體 (7), 當啟動子開始轉錄時, 表達載體將合成原來信使 RNA拷貝, 再用內切酶從表達裁體上切下所加入的 DNA(8), 并以反向插入裁體 ( 9), 轉錄時表達載體將合成反義 RNA.

                                            3.3利用QB復制酶技術擴增

                                            利用QB噬菌體的 MDV- Ⅰ變體 (具有 RNA復制酶的識別和起始序列 )作為載體, 用 RnaseT1將其 63(G)和 64(U)之間切開, 插入外源 RNA片段組成重組 RNA 分子. 將 MDV-Ⅰ的 CDDA與質粒 PBR322組成重組體可以在體外擴增任意長度的RNA分子. 該技術可以在體外高效地拷貝RNA分子序列。

                                            3.4體外人工合成

                                            直接通過核酸合成儀來合成. 化學合成反義RNA的優點是可以隨意設計序列. 缺點是價格比較昂貴, 一般只適用于合成比較小的 RNA分子.

                                            4. 反義 RNA 技術在現代作物遺傳改良中的應用 4.1 利用反義 RNA 技術提高作物的耐儲藏性。

                                            在植物果實成熟的過程中, 隨著呼吸作用的加強和乙烯含量的升高, 果實也發生一系列的物理和化學變化, 包括顏色, 質地等的變化, 使果實容易腐爛變質。為了運輸和儲藏的需要, 以前通常利用物理和化學等方法抑制果實的成熟, 以減少因果實成熟造成的經濟損失。利用反義RNA 技術, 抑制果實組織乙烯的合成, 延緩果實成熟, 可以極大地降低儲運成本。

                                            4.2 在植物抗病蟲中的應用

                                            由于病蟲害日益嚴重, 而目前對付病蟲害的主要方法是化學農藥, 可是化學農藥不但嚴重污染環境, 而且誘導病蟲產生抗性, 因此利用生物農藥和提高農作物自身抗性逐漸形成共識并成為一個發展方向。利用反義RNA專一性的阻斷病毒在宿主細胞中的增殖, 可以增強植物的抗病蟲性。從20 世紀80年代, 將編碼病毒外殼蛋白 ( CP ) 的基因作為目的基因, 獲得轉反義CP 的植株, 高效表達的轉煙草植株在 TMV 存在時, 能維持抗病毒狀態 30d左右, 而正常植株3~4d便出現病狀。這種轉CP基因已經在馬鈴薯,番茄和苜蓿等植物中獲得成功。

                                            4.3.1果實性狀及品質的調控

                                            4.3.1.1果實成熟的生理學和分子生物學.

                                            果實成熟是指果實生長發育停止后發生的一系列生理生化變化的綜合過程,





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